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English to Spanish: Sample Preparation Techniques for Biological Agents General field: Science Detailed field: Biology (-tech,-chem,micro-)
Source text - English 11.3 Sample Preparation Techniques for Biological Agents
11.3.1 General Considerations
Samples, prior to analysis, may be subjected to a variety of preparation techniques. Depending on the type of sample and identification technique used, sample preparation can accomplish the following:
[a] Convert the sample into a format compatible with the detection/identification technology employed.
[b] Homogenise the sample so that microbial agents present within are uniformly distributed. [c] Improve sensitivity through the removal of chemical inhibitor(s) associated with the sample
matrix.
[d] Improve selectivity through the removal or inhibition of competing microbial contaminants. [e] Improve sensitivity through concentration.
Samples may be presented to a laboratory in a number of different forms. For example: air
samples captured in liquid or on filters, samples of water, soil, or vegetation, on swabbing material used to wipe contaminated hard surfaces, or biomedical samples from suspect cases. The aim of processing is to recover the agent of interest from the matrix in which it is contained and to eliminate materials that might interfere with the subsequent analysis. After having effectively recovered and concentrated the agent, it can subsequently be identified by the analytical procedures detailed in Section 11.5.
11.3.2 Wetting
The majority of detection and identification techniques usable with BW agents require the sample to be in a liquid phase. Swab samples are often washed and the resultant solution is analyzed. For solid samples, such as soil, a volume of the solid is homogenised in two or more volumes of liquid and the supernatant is tested. The most common wetting agents are water, saline and pH-balanced buffers.
11.3.3 Detergents
Microbes often form adhesive interactions with surfaces, either the matrix of a solid sample (i.e., humus from soil, plant leaves, rug fibres, etc.) or the solid support of a sampling device (i.e., the cotton of a swab). In order to free microbes from these surfaces so that they enter solution and are loaded into the detection or identification technology non-ionic detergents may be added to the isolation solution to break the adhesive interactions. Some microbes are more resistant to detergents than others. Bacterial spores and mid-spectrum agents can survive treatment with detergent concentrations of 0.5% or greater, while detergent extraction of vegetative bacterial cells should be limited to 0.1% or less. Viruses are very susceptible to destruction via detergents and samples.
CAUTION
In the absence of a clear distinction between virus and bacteria contamination, the use of detergent with suspect B-agent samples should be avoided.
11.3.4 Flotation
Bacterial spores have a high buoyant density and as a result float in solutions of high specific density. A solution of 1.22 g/ml sucrose plus 0.5% Triton X-100 may be used to selectively isolate spores from a sample by breaking the adhesive interactions between the spores and the sample matrix, and floating the freed spores up to the surface of the solution.
11.3.5 Culture Amplification
In some cases it may be worthwhile to pre-incubate a sample in liquid bacterial culture medium in order to amplify the amount of microbe present and thereby increase the sensitivity of the downstream detection technologies. The liquid culture medium and incubation conditions to use depend on the growth requirements of the suspected BW agent. The sample may be cultured for 4 hours to overnight before aliquots of the media are removed for analysis. Note if the liquid medium used is not specific for the suspected BW agents there is a danger that contaminating microbes will grow faster in the medium and will mask the agent of interest resulting in a false negative result. If culture amplification is used, it is strongly suggested that the sample be split and only half of the sample be mixed with liquid medium.
The cultured and uncultured portions of the sample can then be processed separately.
Microbial growth in a sample to which liquid medium has been added is an indication that the sample is biologically active but is not conclusive that any BW agent detected in the sample is viable as
the growth could have been due to contaminant microbes. To prove a BW agent detected in a culture
amplified sample is viable it is necessary to either subculture a portion of the amplified sample on solid agar medium and obtain isolated colonies of the suspect microbe, or to detect an increase in signal in a genetic- or immunological-based assay in the cultured portion of the sample compared to the uncultured portion.
If the suspected BW agent is a virus, the virus may be amplified by adding a portion of the sample to a tissue culture containing a cell line that is susceptible to the virus in question. Culture amplification is
not possible with mid-spectrum agents as they are not self-replicating.
11.3.6 Centrifugation
Centrifugation is a separation technique in which the rotation of a sample at high speeds generates a centrifugal force which can be used to remove contaminates or selectively isolate microbial populations. Soil particles, fibres, and animal cells collect at the bottom of a centrifuge tube at speeds of
2,000 to 3,000 g while microbial cells remain suspended in the supernatant. Bacterial cells and spores collect at the bottom of a tube at speeds of approximately 10,000 g while ultracentrifuges are required to achieve the speeds in excess of 100,000 g necessary to pull virus particles out of solution.
11.3.7 Filtration
With filtration, an aqueous sample is passed through a filter using positive pressure or vacuum. The filter itself can be composed of a variety of materials such as stainless steel, cellulose acetate, Teflon, nylon and polyvinylidene difluoride. Depending on the volume to be filtered, the filter unit may attach directly to a low volume syringe or may be part of a larger filtration apparatus. Depending on the pore size of the filter, a BW agent may be purified from larger environmental particles by passing through the filter or it may be concentrated on the surface of the filter if it is larger than the pores. It is also possible to lyse BW agents in a sample and then pass the suspension through a filter to purify components, such as DNA or protein antigens, for application to detection technologies. Low recovery of nucleic acids or proteins due to adsorption onto the filter is a potential problem when attempting to
isolate BW agent components as well as mid-spectrum agents. Note if purifying bio molecules via lysis and filtration, only treat a portion of the sample with the lytic agents so that the remainder of the sample can be analyzed via culture and biochemical methods.
11.3.8 Animal Inoculation
Inoculation of samples into laboratory animals may be necessary if a rapid identification is required for treatment of exposed individuals exhibiting illness, or to resolve tense political or military situations. Animal inoculation may also be used when there is no alternative artificial culture medium available for the BW agent in question. The inner environment of the laboratory animal provides optimal conditions for a pathogenic BW agent to multiply and thrive while non-pathogenic environmental contaminants are unable to survive thus animal inoculation may act as both a purification and amplification step. Death of the animal and subsequent isolation of the suspect BW agent from the carcass is proof that the agent is not only viable but fully virulent.
Translation - Spanish 11.3 Técnicas de preparación de muestras para agentes biológicos
11.3.1 Consideraciones generales
Antes de analizarse, las muestras pueden ser objeto de diversas técnicas de preparación. Según el tipo de muestra y la técnica de identificación utilizada, la preparación de la misma puede implicar lo siguiente:
[a] Conversión de la muestra a un formato compatible con la tecnología de detección/identificación empleada.
[b] Homogeneización de la muestra para que los agentes microbianos presentes estén distribuidos de forma uniforme.
[c] Mejora de la sensibilidad mediante la retirada del/de los inhibidor(es) químico(s) asociado(s) con la matriz de la muestra
[d] Mejora de la selectividad mediante la retirada o inhibición de los contaminantes microbianos conflictivos.
[e] Mejora de la sensibilidad mediante la concentración.
Las muestras se pueden entregar al laboratorio de varias formas diferentes. Por ejemplo: las muestras de aire capturadas en líquidos o en filtros, muestras de agua, tierra o vegetación en hisopos de algodón pasados sobre superficies rígidas contaminadas o muestras de origen biomédico de casos sospechosos. El objetivo del procesado es recuperar el agente de interés de la matriz en la que está contenido y eliminar materiales que podrían alterar el posterior análisis. Tras haber recuperado y concentrado de forma efectiva el agente, puede identificarse posteriormente mediante los procedimientos analíticos detallados en la Sección 11.5.
11.3.2 Humectante
Para la mayoría de las técnicas de detección y de identificación que se pueden utilizar con agentes biológicos es necesario que la muestra esté en fase líquida. Las muestras de los hisopos se suelen lavar y se analiza la solución resultante. Para muestras sólidas, como la tierra, una parte del sólido se homogeneiza en dos o más partes de líquido y se analiza el sobrenadante. Los agentes humectantes más comunes son el agua, el salino y los amortiguadores del pH.
11.3.3 Detergentes
Los microbios suelen formar interacciones adhesivas con las superficies, ya sea de la matriz de una muestra sólida (es decir, mantillo de la tierra, hojas de las plantas, fibras de la alfombra, etc.) o del soporte sólido de un dispositivo de toma de muestras (es decir, el algodón de un hisopo). Para liberar los microbios de esas superficies de modo que se introduzca solución y se carguen en la tecnología de detección o identificación, se pueden añadir detergentes no iónicos a la solución de aislamiento para romper las interacciones adhesivas. Algunos microbios son más resistentes a los detergentes que otros. Las esporas bacterianas y los agentes de espectro medio pueden sobrevivir al tratamiento con concentraciones de detergente del 0,5% o superiores, mientras que la extracción de detergente de las células bacterianas vegetativas debería limitarse al 0,1% o menos. Los virus tienden a destruirse por medio de detergentes y muestras.
ADVERTENCIA
En ausencia de una clara distinción entre la contaminación por virus y por bacterias, debería evitarse el uso de detergente con muestras de agentes biológicos sospechosos.
11.3.4 Flotación
Las esporas bacterianas tienen una alta densidad de flotación y en consecuencia flotan en soluciones con alta densidad específica. Una solución de 1,22 g/ml de sacarosa más Tritón X-100 al 0,5% puede utilizarse para aislar de forma selectiva las esporas de una muestra rompiendo las interacciones adhesivas entre las esporas y la matriz de la muestra y haciendo que floten las esporas liberadas hasta la superficie de la solución.
11.3.5 Amplificación del cultivo
En algunos casos merece la pena preincubar una muestra en un medio de cultivo bacteriano líquido para amplificar la cantidad de microbios presentes y de ese modo aumentar la sensibilidad de las tecnologías de detección aguas abajo. El medio de cultivo líquido y las condiciones de incubación para utilizarlo dependen de los requisitos de crecimiento del presunto agente biológico. La muestra puede cultivarse entre 4 horas y toda la noche antes de quitar las alícuotas de los medios para el análisis. Sepa que si el medio líquido utilizado no es específico para el presunto agente bacteriológico existe el peligro de que los microbios contaminantes crezcan más rápido en el medio y oculten el agente de interés, lo que dará como resultado un falso negativo. Si se utiliza la amplificación del cultivo, es muy recomendable que se divida la muestra y solo se mezcle la mitad de la muestra con el medio líquido. Las porciones cultivadas y no cultivadas de la muestra se pueden procesar por separado.
El crecimiento microbiano en una muestra a la que se le ha añadido un medio líquido es un indicio de que la muestra es biológicamente activa pero no es concluyente de que cualquier agente biológico detectado en la muestra sea viable ya que el crecimiento podría haberse debido a los microbios contaminantes. Para demostrar que es viable un agente biológico detectado en una muestra amplificada de cultivo es necesario bien subcultivar una porción de la muestra amplificada en medio de agar sólido y obtener colonias aisladas del presunto microbio, bien descubrir un incremento en la señal en un ensayo genético o inmunológico en la porción de la muestra cultivada en comparación con la porción no cultivada.
Si el presunto agente biológico es un virus, este se puede amplificar añadiendo una porción de la muestra a un cultivo de tejidos que contenga una línea celular susceptible al virus en cuestión. La amplificación del cultivo no es posible con agentes de espectro medio ya que no se autorreplican.
11.3.6 Centrifugación
La centrifugación es una técnica de separación en la que la rotación de una muestra a alta velocidad genera una fuerza centrífuga que se puede usar para eliminar contaminantes o aislar de forma selectiva poblaciones microbianas. Las partículas de tierra, las fibras y las células animales se acumulan al fondo de un tubo de centrífuga a velocidades de entre 2.000 y 3.000 G mientras que las células microbianas permanecen suspendidas en el sobrenadante. Las células y esporas bacterianas se acumulan al fondo de un tubo a velocidades de aproximadamente 10.000 G mientras que se necesitan ultracentrifugadoras para alcanzar velocidades superiores a 100.000 G, necesarias para separar las partículas del virus de la solución.
11.3.7 Filtración
Con la filtración, una muestra acuosa se pasa a través de un filtro utilizando presión positiva o el vacío. El filtro en sí se puede componer de diversos materiales tales como el acero inoxidable, el acetato de celulosa, el Teflón, el nailon y el difluoruro de polivinilideno. Según el volumen que se deba filtrar, la unidad de filtro se puede unir directamente a una jeringuilla de bajo volumen o puede ser parte de un aparato de filtración mayor. Según el tamaño de poro del filtro, se puede purificar un agente biológico de partículas ambientales más grandes pasándolo por un filtro o se puede concentrar en una superficie del filtro si es más grande que los poros. También es posible lisar agentes biológicos en una muestra y después pasar la suspensión a través de un filtro para purificar componentes como el ADN o los antígenos proteicos, para aplicaciones en tecnologías de detección. La baja recuperación de ácidos nucleicos o proteínas debido a la adsorción sobre el filtro es un problema potencial cuando se intentan aislar componentes de agentes biológicos y de espectro medio. Sepa que si se purifican biomoléculas por medio de la lisis o la filtración, solo se trata una porción de la muestra con los agentes líticos para que el resto de la muestra se pueda analizar por medio de cultivos y métodos bioquímicos.
11.3.8 Inoculación animal
Puede ser necesaria la inoculación de muestras en animales de laboratorio si se requiere una rápida identificación para el tratamiento de individuos expuestos que presenten la enfermedad o para resolver situaciones políticas o militares tensas. La inoculación animal se puede utilizar también cuando no hay disponible un medio de cultivo artificial alternativo para el agente biológico en cuestión. La inoculación del animal de laboratorio proporciona condiciones óptimas para que un agente biológico patógeno se multiplique y se desarrolle mientras los contaminantes ambientales no patógenos no sean capaces de sobrevivir, por lo que la inoculación animal puede ser tanto un paso de purificación como de amplificación. La muerte del animal y el posterior aislamiento del presunto agente biológico del cadáver es una prueba de que el agente no solo es viable sino que es totalmente virulento.
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Master's degree - Universidad de Salamanca
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Years of experience: 15. Registered at ProZ.com: Sep 2012.
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