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Source text - Italian Introduzione
1.1 Scopo del programma RealTime_PCR v.7.3
Il programma RealTime_PCR v.7.3 serve a controllare il termociclatore SaCycler-96 e ad analizzare i risultati ottenuti dei programmi di amplificazione. Il programma ha le seguenti funzioni:
Creazione e editing del test;
Creare un registro di ricerca;
Creazione, avvio e controllo della corsa del programma di amplificazione;
Analisi dei dati delle misure ottiche;
Creazione di un rapporto di ricerca.
Il programma RealTime_PCR v.7.3 è progettato per applicazioni in laboratori clinici; quindi le funzioni di controllo e la regolazione dell’analisi dei risultati sono semplificate al massimo. L’utente se lo desidera, può cambiare allo stesso tempo i parametri di operazione e i dati di analisi con l’aiuto di impostazioni supplementari del programma RealTime_PCR v.7.3.
1.2 Caratteristiche principali del programma RealTime_PCR v.7.3
Controllo del sistema Real-Time PCR SaCycler-96.
Il programma è progettato per controllare il termociclatore SaCycler-96 quando si prepara ed esegue l’amplificazione e l’analisi dei risultati delle misure ottiche ottenute. L’interfaccia del programma cambia automaticamente secondo il tipo di strumento connesso.
Nozione di Test.
Quando si utilizzano test commerciali e si eseguono esami singoli, i parametri dei protocolli sono standard e differiscono di norma nel numero di campioni e nella loro disposizione nel blocco termico dello strumento.
Nel programma in oggetto è integrato nella nozione di Test un gruppo di parametri di protocollo singoli, necessari per completare la PCR e la succesiva analisi.
La sezione Test comprende i seguenti parametri di protocollo:
1. Condizioni della temperatura di amplificazione (programma di amplificazione).
2. Tipo di campioni utilizzati: campioni sotto analisi, controlli, campioni di calibrazione (“standard”), la loro quantità e concentrazione (per gli “standard”).
3. Tipo di fluorofori (etichette di fluorescenza) e obiettivo dei corrispondenti segnali (specifiche, controllo interno ecc.).
4. Volume della mix di reazione.
5. Informazioni supplementari sull’esame: nome del test, descrizione dei campioni ecc.
6. Tipo di analisi dei risultati.
Quando si esegue un protocollo di ricerca è sufficiente specificare il nome del test (in questo caso tutti i parametri necessari saranno scaricati automaticamente) , il numero dei campioni e la loro disposizione nel blocco termico.
Modalità multi-test per l’analisi dei polimorfismi (melting).
Due modalità di lavoro del programma realizzate in finestre indipendenti:
- Gestione strumento
- Visualizzatore archivio dati
rendono possible operare simultaneamente con lo strumento e eseguire l’analisi dei risultati delle corse precedenti.
Possibilità di operare contemporaneamente con più strumenti che si concretizza attraverso due metodi:
Modalità a singola finestra. Il programma RealTime_PCR v.7.3 viene avviato una sola volta indipendantemente dal numero di strumenti alimentati e connessi al computer e consente di controllare il lavoro di un singolo strumento selezionato. Lo strumento da tenere sotto controllo viene selezionato premendo il tasto e nella finestra List of devices (elenco dei dispositivi) (Fig. 3) che appare sul monitor nel corso del programma di avvio o attraverso il menu Settings/List of devices (impostazioni/ elenco dei dispositivi).
Modalità multi finestra. Per controllare ciascuno degli strumenti alimentati, il programma RealTime_PCR v.7.3 viene avviato in una finestra individuale. Questa modalità rende possible il controllo di più strumenti simultaneamente.
Possibilità di impostare un gradiente di temperatura verticale o orizzontale sul blocco termico.
Due metodi alternativi di analisi della curva del DNA raccolto nel corso della PCR (reazione a catena della polimerasi): metodo della soglia (Ct) e metodo della forma della curva (Cp), che sono basati su differenti approcci per la determinazione del ciclo distintivo di amplificazione.
Il metodo della soglia (Ct) si basa sul disegnare una linea di “soglia” parallela alla asse X e e sulla determinazione del numero del ciclo di reazione (threshold cycle) su cui la linea di soglia interseca la curva di amplificazione della provetta. Il ciclo soglia è una delle versioni dei cicli caratteristici.
Il metodo della forma della curva (curve shape method) (Cp) è basato sull’analisi matematica della forma della curva del DNA raccolto nel corso della PCR.
Durante l’analisi delle misure ottiche, il programma RealTime_PCR v.7.3 usa per impostazione predefinita il metodo della forma della curva (Cp). In caso di situazioni non standard, quando la curva di amplificazione differisce sostanzialmente dalla classica curva del DNA raccolto nel corso della PCR (sigmoide), l’analisi dei risultati avviene attraverso l’utilizzo del metodo della soglia (Ct) che in questi casi presenta un’immagine più corretta.
Nuovi tipi di analisi;
Analisi dei polimorfismi (melting)
HLA DRB
Biocenosi
Inoltre, durante l’avanzamento del programma, possono essere aggiunti altri tipi di analisi dei risultati delle misure ottiche.
1.3 Descrizione del menu del programma RealTime_PCR v.7.3
Il menu di base del programma RealTime_PCR v.7.3 consiste in quattro sezioni:
Modo
Test
Impostazioni
Aiuto
La sezione Mode serve per controllare il lavoro del programma e include i seguenti comandi:
Device Handling (Gestione del dispositivo) – il comando è attivo nella modalità Archive Viewer (visualizzatore archivio) e serve per passare al Device handling (gestione del dispositivo).
Data Archive Viewer (visualizzatore archivio dati) – il comando è attivo in modalità Device handling e serve per passare alla modalità Archive Viewer.
Amplification program Editor – richiama la finestra editor del programma di amplificazione.
Video-archive Viewer – visualizza la finestra Video-archive viewer (visualizzatore archivio video).
Exit – esce da una certa modalità del programma e chiude la finestra corrispondente.
La sezione Test serve per creare e editare i test e include i seguenti comandi:
Creare/Editare test – visualizza la finestra dei Test per creare un nuovo test o editare uno già esistente
Aggiungere un gruppo di test dal file – visualizza la finestra Add a group of tests from the file per selezionare un file con i test da aggiungere.
La sezione Impostazioni (Settings) serve a visualizzare e editare le impostazioni dello strumento e include i seguenti comandi:
Configurazione delle impostazioni:
Salvare le configurazioni correnti per impostazione predefinita o in un file con estensione *.rtc;
Scaricare le configurazioni standard (aziendali) o le configurazioni dal file con estensione *.rtc.
View Image – visualizza la finestra View Image per modifiche allo strumento e la sua diagnostica.
Set exposition – visualizza la finestra Set exposition per modifiche allo strumento e la sua diagnostica.
Last Run in device – legge i risultati delle misure ottiche dell’ultima corsa.
List of devices – visualizza l’elenco dei dispositivi - List of devices- per connetterli o disconnetterli.
Device diagnostics:
Visualizza la finestra della barra di comando-Command line- per la diagnostica dei micro regolatori dello strumento;
Visualizza la finestra Monitoring per rappresentare continuamente le informazioni richieste per la diagnostica dello strumento;
Misura l’altezza della provetta – avvio della procedura di misura dell’altezza delle provette
Salvataggio dei valori ottenuti per eseguire le conseguenti misure ottiche;
Visualizzazione della finestra per leggere l’SD card (Reading SD card);
display della finestra Browsing of instrument video-archive;
Options – schermata della finestra delle opzioni (Options) per eseguire le impostazioni dell’utente e le configurazioni dei parametri di analisi.
Miscellaneous – schermata della finestra dei coefficienti (List of setting coefficients).
La sezione Help include il manuale on-line del programma RealTime_PCR v.7.3 e le informazioni sulla versione del programma:
Avvio del programma
Il programma RealTime_PCR v.7.3 può essere avviato attraverso due metodi:
1. Dalla voce Start del menu del sistema operativo Windows:
Start → All programs → RealTime_PCR → RealTime_PCR
2. Cliccando sull’icona sul Desktop (quando si installa il programma, questa icona si posiziona automaticamente sul desktop).
Dopo l’avvio del programma la finestra per selezionare la modalità di lavoro del programma (Fig. 1) mostra sullo schermo:
Fig.1. Finestra per la selezione della modalità di lavoro del programma
In questa finestra devono essere eseguite le seguenti operazioni:
Selezionare un operatore esistente o aggiungere un nuovo operatore.
La selezione dell’operatore esistente avviene dall’elenco Operatore.
L’aggiunta di un nuovo operatore avviene selezionando la voce Add Operator (aggiungi operatore) dall’elenco Operatore.
La selezione della voce Add Operator risulta nella finestra Add Operator visualizzata sullo schermo. (Fig.2).
Fig.2. Finestra“Aggiungi operatore”
Questa finestra richiede la compilazione delle caselle Operator e Directory.
Il nome dell’operatore deve essere inserito nella casella Operator.
La casella Directory deve indicare il percorso della cartella dell’operatore sull’hard disk del computer (per selezionare la cartella, premere il tasto Browse… ). Se si lavora con il nome fornito dell’operatore, tutti i file (protocolli, programmi di amplificazione, ecc.) saranno salvati in questa cartella, se non specificato diversamente.
Cliccare OK per salvere i dati immessi e ritornare alla finestra di selezione della modalità di lavoro del programma.
Per selezionare una delle due possibili modalità del programma:
Modalità Device handling (gestione dispositivo) (la finestra ) abilita a:
Creare e editare testi;
Creare e editare programmi di amplificazione;
Creare e editare protocolli delle successive corse;
Monitorare lo stato del programma di amplificazione;
Eseguire diagnostica e modifiche allo strumento.
Modalità Data archive viewer (visualizzatore archivio dati) (la finestra ) abilita a:
Analizzare i dati delle misure ottiche dei protocolli salvati;
Redarre rapporti sui risultati delle misure.
Nota: é possible eseguire operazioni simultanee in due modalità (ad es. eseguire l’analisi dei dati ottenuti precedentemente mentre è in corso il programma di amplificazione).
3 Modalità “gestione del dispositivo”
3.1 Scopo delle diverse modalità
La modalità Device Handling del programma RealTime_PCR v.7.3 serve a creare protocolli, costruire programmi di amplificazione, specificare i parametri di amplificazione, eseguire amplificazioni e impostare i parametri dello strumento. In questa modalità è utilizzata la finestra .
Per entrare in questa modalità può essere utilizzata una delle seguenti tecniche:
1. Scegliere la modalità Device Handling quando si avvia il programma RealTime_PCR v.7.3.
2. Scegliere la voce Device Handling dal menu Mode nella finestra Archive.
3. Cliccare nella finestra Archive.
La finestra dell’elenco dei dispositivi (List devices) sarà visualizzata sullo schermo con l’elenco degli strumenti connessi al computer (Fig. 3).
Fig.3.Finestra di connessione degli strumenti
Per operare su uno specifico strumento, selezionarlo dall’elenco e premere il tasto . Il programma RealTime_PCR v.7.3 sarà pronto a far partire questo particolare strumento. Per procedere con un altro strumento (in modalità a singola finestra) disconnettere lo strumento in questione premendo il tasto , selezionare lo strumento richiesto nell’elenco e premere ancora il tasto .
Nella modalità a finestre multiple, per lavorare con ciascuno strumento viene avviato il programma in una finestra singola, tramite una delle tecniche descritte in precedenza in questa sezione. In questo caso è possible controllare il lavoro di più strumenti simultaneamente.
Il lavoro nella modalità Device Handling consiste nei seguenti passaggi:
1. Preparazione dello strumento per il lavoro (impostazione dei parametri dello strumento, esposizione ecc.).
2. Creazione del protocollo di ricerca e specifica dei parametri di amplificazione.
3. Avvio del programma di amplificazione.
La configurazione dei parametri dello strumento avviene di solito durante la procedura di intallazione da parte di personale specializzato ed è descritta nella sezione “Impostazioni e diagnostica dello strumento” di questo manuale.
Per semplificare la procedura di creazione dei protocolli si raccomanda di salvare i parametri dei protocolli standard sotto forma di Test.
3.2 Creazione/editing dei test (solo per versione SaCycler-96 RUO)
3.2.1 Creazione di un uno nuovo test
1. Per creare un nuovo test, selezionare il comando Create/Edit test nel menu Test nella finestra RealTime_PCR v.7.3 e premere il tasto Create a new test.
2. Nella finestra che appare
Inserire il nome del nuovo test e cliccare OK. La finestra Test apparirà sullo schermo.
3. Inserire i parametri del test nelle caselle corrispondenti della finestra Test (vedi sezione 3.2.3).
4. Cliccare ОK per salvare i parametri e chiudere la finestra Test.
3.2.2 Editing dei test
1. Per eseguire l’editing dei test, selezionare il comando Create/Edit test nel menu Test della finestra RealTime_PCR v.7.3.
2. Nelle finestra che appare
Scegliere il test richiesto dall’elenco e premere il tasto . La finestra Test apparirà sullo schermo (Fig.4).
3. Cambiare la casella necessaria della finestra Test (see 3.2.3).
4. Cliccare ОK per salvare i parametri inseriti e chiudere la finestra Test.
3.2.3 Parametri dei test
La descrizione del test e i parametri sono specificati nella finestra Test.
L’elenco a tendina Test serve a selezionare un test. Quando si seleziona un elemento dall’elenco, i parametri del test selezionato vengono rappresentati nella finestra Test.
Si raccomanda di specificare lo scopo del test e le sue particolarità nella casella Description.
Fig.4. Finestra “Test”
Inserire i Parametri necessari per l’esecuzione della PCR e l’analisi dei risultati.
Nota: Se si utilizzano dei test commerciali, i parametri necessari sono specificati nella descrizione dei test.
Descrizione dei parametri:
Analisi
Nella sezione Analisi scegliere i parametri Tipo e il Metodo di analisi.
Tipo
In questa versione del programma sono forniti i seguenti tipi di analisi:
Qualitativa – determinazione della presenza o assenza di un frammento di DNA target nel campione. I risultati sono rappresentati sotto forma di valori: sia “positivo” che “negativo” (“ ” or “-“ ). Se si utilizza un controllo interno, il livello di affidabilità dei risultati è approssimativo.
Analisi quantitativa con standard – valutazione di una quantità assoluta di frammento di DNA target nel campione. Per eseguire l’analisi è richiesta la calibrazione dei campioni (standard) – campioni con una data quantità di DNA target.
Relativa – valutazione di una quantità relativa di frammento del DNA target nei campioni sotto osservazione. La quantità di DNA in tutti i campioni è calcolata rispetto a un campione di riferimento scelto dall’utilizzatore. Qualsiasi campione può essere scelto come campione di riferimento.
Curva di melting – valutazione del punto di fusione dei prodotti amplificati. L’analisi richiede l’uso di coloranti fluorescenti intercalanti di tipo SYBR.
Analisi dei polimorfismi (due probe) – analisi dei polimorfismi genetici, ad es. Polimorfismi nucleotidi singoli (SNP) utilizzando due diversi fluorofori in una sola provetta. L’analisi è orientata verso l’amplificazione simultanea di due versioni di allele in una sola provetta e la loro rilevazione attraverso due differenti fluorofori. I risultati sono valutati attraverso la presenza e il valore dello spostamento relativo delle curve di amplificazione registrate in una provetta con due fluorofori (dCp or dCt).
Analisi dei polimorfismi, fusione (melting).
HLA DRB – Genotipizzazione (tipizzazione dell’HLA).
GMI – determinazione della presenza e della concentrazione di ingredienti geneticamente modificati nei campioni.
Biocenosi – esame della biocenosi.
Rilevazione multipla – rilevazione simultanea di un numero (fino a 4/5) di frammenti di DNA specifico.
Metodo
Nel programma sono eseguiti i seguenti metodi di analisi:
Threshold (Ct) – determinazione del ciclo di amplificazione soglia Ct (threshold cycle). Questo metodo si basa sul disegnare una linea di “soglia” (threshold) e sul determinare il numero dei cicli in cui la curva di amplificazione interseca la linea di soglia per ogni campione.
Nota: Per cambiare i valori del ciclo soglia cliccare Additional e cambiare il parametro “2. Threshold value…” nella finestra Additional parameters.
Per maggiori dettagli sui parametri supplementari, fare riferimento alla sezione “Setting analysis parameters” (Impostazione dei parametri di analisi).
Forma della curva (Cp) – determinazione di un ciclo distintivo sulla base di analisi matematiche della forma della curva di amplificazione.
Provette
Selezionare il tipo di campioni che saranno utilizzati nel corso della ricerca.
Sample – campione sotto esame;
Standard – campione di calibrazione richiesto per l’analisi quantitativa;
Control – campione di riferimento positivo;
Control – – campione di riferimento negativo.
Standard
Quando si seleziona l’analisi di tipo Quantitativa con standard (Quantitative with standards), descrivere i campioni di calibrazione utilizzati (“standard”).
Le seguenti informazioni devono essere specificate a questo scopo:
Inserire nella casella Quantity – la quantità delle varie concentrazioni dei campioni di calibrazione (“standard”).
Nella casella Copy – specificare il numero delle provette per ogni concentrazione di campione di calibrazione (“standard”).
Compilare la tabella dei valori degli “standard” (specificare il nome e la concentrazione di ogni “standard”).
Il numero di righe di una tabella corrisponde alla quantità di versioni di “standards”. Programmare un nome per ogni “standard” (per impostazione predefinita è “Standard_1”, “Standard_2” e così via) e specificare il valore (concentrazione dello “standard” ). Le unità di misura (copie, picogrammi, IU) possono essere selezionate dall’elenco nel titolo della colonna a destra della tabella.
La tabella dei valori può essere compilata manualmente o automaticamente. Per la compilazione automatica premere il tasto Serial titration (Titolazione seriale), nella finestra corrispondente compilare la casella Initial value e Titration step e cliccare OK.
I dati nella tabelle dei valori degli “standard” possono presentarsi in due formati: usuale e scientifico. La scelte del formato di presentazione avviene attraverso l’alternatore di Formato.
Esempio. Scrivere le cifre nei formati usuale e scientifico (nel formato scentifico l’elevazione a potenza di 10 (esponente) del numero deve essere specificata dopo la lettera “E”).
Usuale Scientifico
5 5,00Е 00
15 1,50Е 01
250 2,50Е 02
9 500 9,50Е 03
18 500 000 1,85Е 07
Controlli
Nella sezione Controlli si deve specificare la quantità di provette con campioni di riferimento utilizzata nell’esame.
Positivo (K ) – quantità di provette con campioni di riferimento positivi.
Negativo (K-) – quantità di provette con campioni di riferimento negativi.
Nota: La quantità di provette con calibrazione e campioni di riferimento può essere cambiata in caso di necessità nel corso della preparazione del protocollo di ricerca (vedi “sviluppo di un protocollo”).
Volume della mix
Nella casella volume della mix (Mixture volume) deve essere specificato il volume della mix di reazione, senza considerare il volume dell’olio o della paraffina (se utilizzati).
Per rispettare accuratamente le condizioni della temperatura di amplificazione, lo strumento SaCycler-96 utilizza il metodo “attivo” della regolazione della temperatura della mix di reazione all’interno della provetta. Il metodo è basato sull’applicazione di un modello matematico della reazione della provetta e richiede un’accurata impostazione del volume della mix di reazione.
Fluorofori
La tabella Fluorophors contiene l’indicazione dello scopo di ogni fluoroforo quando si esegue l’analisi dei risultati:
Specifics – segnale specifico principale.
IC – segnale da un campione di riferimento interno.
La voce absent deve essere selezionata nella tabella se non è usato un fluoroforo specifico.
Se si seleziona il tipo di analisi Analysis of polymorphisms (two probes), lo scopo del segnale del fluoroforo può essere specificato (per impostazione predefinita è “Version 1” e “Version 2”).
Norme per l’analisi dei polimorfismi (due probe)
La sezione è attiva se viene selezionato come tipo di analisi Analysis of polymorphisms (two probes).
Se si conduce l’analisi dei polimorfismi utilizzando due probe, i risultati sono valutati attraverso la presenza e il valore dello spostamento relativo delle curve di amplificazione registrato in una provetta per due fluorofori (dCp or dCt). Se non c’è alcuno spostamento o se esso è inferiore al valore specificato nella casella Heterozygote dCp, il risultato è considerato eterozigota, ovvero entrambe le versioni sotto analisi sono presenti.Se lo spostamento supera il valore specificato nella casella Homozygote dCp, il risultato è considerato omozigota, ovvero è presente una sola versione- con valore inferiore di Cp. Nel resto dei casi il risultato deve essere considerato come indefinito e si richiede un riesame.
Programma di amplificazione
Nella sezione Amplification program, il programma di amplificazione deve essere indicato con una della seguenti tecniche:
Selezionare un programma precedente archiviato nel disco utilizzando ,
Creare un nuovo programma di amplificazione utilizzando ,
Editare il corrente programma di amplificazione utilizzando .
Il programma di amplificazione selezionato verrà presentato in questa sezione.
Per maggiori dettagli sulla creazione e l’editing del programma di amplificazione vedi la sezione 3.3 “Creazione e editing dei programmi di amplificazione”.
Parametri supplementari
Cliccare Additional per aprire la finestra Parameters of the analysis.
Vedi sezione 8. Setting of analysis parameters per la descrizione dei parametri supplementari di analisi
ATTENZIONE! Questa sezione è destinata a utilizzatori esperti. Nella maggior parte dei casi non è necessario cambiare i valori di impostazione predefinita dei parametri di analisi. Un cambiamento in questi parametri sarebbe salvato nelle impostazioni del programma e potrebbe causare in futuro interpretazioni scorrette dei risultati.
3.3 Creazione dei programmi di PCR (solo per versione SaCycler-96 RUO)
3.3.1 Creazione di un nuovo programma di amplificazione
La creazione di un nuovo programma di amplificazione è possibile in differenti stadi del lavoro con il programma RealTime_PCR v.7.3:
1. Nel creare e editare i test:
Aprire la finestra Test (vedi articolo 3.1.2).
Premere il tasto Create new program nella sezione 8. Amplification program.
2. Prima di avviare il programma di amplificazione:
Selezionare il tab Start program della finestra RealTime_PCR.
Cliccare il tasto Create new program.
3. Quando è in corso l’Editor del programma di amplificazione:
Selezionare il menu della finestra Amplification program editor:
- Creare un nuovo programma.
Quando si crea un nuovo programma di amplificazione con uno dei metodi specificati, apparirà sullo schermo la finestra Amplification program template. Una struttura di programma di amplificazione può essere programmata con l’aiuto del templato.
Un nuovo programma di amplificazione può essere creato con l’utilizzo dell’Amplification program template o senza di esso.
Creare un nuovo programma di amplificazione utilizzando un templato del programma di amplificazione (Amplification program template)
Per creare un nuovo programma di amplificazione utilizzando un templato procedere come di seguito:
1. Selezionare il comando Create amplification program (vedi 3.3.1) e si aprirà la finestra Amplification program editor e quella Amplification program template.
La finestra Amplification program template (Fig.5) rappresenta schematicamente le parti del programma di amplificazione: unità a due- e 3 stadi dei cicli di temperatura, modalità di preriscaldamento e mantenimento.
2. Selezionare un templato con la struttura più adatta.
Fig.5. Finestra “Amplification program template”
3. In caso di necessità aggiungere le modalità Preliminary heating (riscaldamento preliminare) e Holding mode (modalità di mantenimento) (spuntare le caselle corrispondenti).
4. Dopo aver selezionato il templato più adatto cliccare Apply.
Le informazione programmate dal templato saranno rappresentate nella finestra Amplification program editor (Fig. 6).
5. Editare il programma di amplificazione:
Inserire il nome del programma nella casella Program name
Se necessario compilare la casella Description
Cambiare i dati necessari nella tabella del programma di amplificazione.
Fig.6. Finestra “Amplification program editor”
Cambiamento nei dati della tabella del programma di amplificazione
Ogni riga della tabella corrisponde ad un livello di temperatura del programma di amplificazione. I livelli di temperatura possono essere aggregati in blocchi.Il numero delle linee di un blocco determina la quantità di livelli di temperatura in un certo stadio del lavoro del programma. Nella tabella i blocchi sono separati da righe vuote.
L’aggiunta o rimozione di livelli di temperatura avviene rispettivamente premendo i tasti (il tasto è attivo solo dopo aver completato l’editing delle altre linee) e .
In ogni linea (per ogni livello di temperatura) devono essere editate le seguenti informazioni:
1. Livello di temperatura - ;
2. Durata del livello - e ;
3. Presenza di misure ottiche - .
ATTENZIONE! É consentita una sola misurazione ottica nella portata di un blocco.
Evitare caselle di temperatura e valori temporali prive di input nel programma (!)
L’aggiunta o la rimozione dei blocchi avviene utilizzando i tasti e .
Per ogni blocco deve essere specificato il tipo di blocco.
1. Cycle (indicato per impostazione predefinita durante la creazione del blocco) – preimposta una modalità di ripetizione dell’esecuzione del programma in un dato stadio fino al completamento della quantità di cicli programmata;
2. Pause – mette in pausa l’esecuzione del programma;
3. Holding – imposta una temperatura di mantenimento dopo l’esecuzione del programma;
Attenzione! La modalità "Holding" (mantenimento) può essere impostata solo alla fine del programma.
4. Melting curve– fa si che si possano ottenere le curve di melting per la valutazione della lunghezza dei frammenti amplificati.
La scelta della voce Melting curve consente di creare un blocco di temperature di un solo livello, con temperatura iniziale di 90°C, quantità di cicli uguale a 60 e incremento della temperatura ad ogni livello uguale a -0.5°C. I parametri iniziali del blocco della “Melting curve” possono eseere editati.
Il numero dei cicli deve essere specificato per ogni unità.
In caso di necessità, per ogni livello di temperatura può essere programmato in aggiunta quanto segue:
La differenza di temperatura secondo la griglia (rappresentata nella tabella di amplificazione attraverso la colonna designata con );
Incremento del tempo (rappresentato nella tabella di amplificazione attraverso la colonna designata con ).
Incremento della temperatura (rappresentato nella tabella di amplificazione attraverso la colonna designata con ).
Per rappresentare i parametri menzionati specificati devono essere spuntate le opzioni corrispondenti della tabella:
Nelle sezioni corrispondenti di questo manuale è descritto come editare i parametri menzionati.
Nel corso della creazione/editing del programma di amplificazione, una presentazione a grafico del programma di amplificazione viene visualizzata nella parte bassa della finestra Amplification program editor. Ad ogni cambiamento nel valore del livello della temperatura, della sua durata, della quantità dei blocchi di temperatura, della quantità dei cicli, cambio di tipo di blocco ecc., le modifiche vengono visualizzate nella presentazione grafica del programma di amplificazione.
Il valore del livello della temperatura può essere cambiato editando l’immagine grafica del programma di amplificazione. Per fare ciò il puntatore del mouse deve essere portato al livello di temperatura (il puntatore prende la forma di ) e tenendo premuto il tasto sinistro del mouse per posizionare (in verticale) il livello alla temperatura richiesta.
La rappresentazione in diagramma del programma di amplificazione può essere cambiata con l’aiuto del menu rapido (richiamato con il tasto destro del mouse) che include le seguenti voci:
Per mostrare il livello della temperatura
Per mostrare il livello di durata nel tempo
Per mostrare informazioni sul gradiente e l’incremento (differenza di temperatura attraverso la griglia, incremento nel tempo e nella temperatura)
Per cambiare la risoluzione della disposizione dei livelli (appare una finestra che assicura la selezione di uno dei tre valori di risoluzione della disposizione dei livelli: 1°C, 0,5°C , 0,1°C).
Creazione di un nuovo programma di amplificazione senza templato di programma di amplificazione.
Per creare un nuovo programma di amplificazione senza templato, devono essere eseguite le seguenti fasi:
1. Selezionare il comando Create amplification program (see 3.2.1). Apparirà la finestra Amplification program editor e la finestra Amplification program template.
2. Premere il tasto Cancel nella finestra Amplification program template.
3. Inserire il nome del programma nella casella Program name.
4. Se necessario compilare la casella Description.
5. Compilare la tabella con il programma di amplificazione analogamente alla creazione del programma di amplificazione, utilizzando uno templato.
Nota: La tabella con il programma di amplificazione può essere compilata in entrambi i casi utilizzando i tasti di edit sulla destra della tabella e della tastiera.
Compilazione della tabella del programma di amplificazione utilizzando la tastiera:
Per compilare la tabella del programma di amplificazione utilizzando la tastiera, le caselle della temperatura e il tempo (minuti, secondi) devono essere compilate successivamente. L’input di ogni nuovo valore deve essere completato premendo il tasto .
Dopo aver inserito tutti i parametri (temperatura, minuti e secondi) della riga corrente, una nuova riga dello stesso blocco con le caselle di imput vuote appare automaticamente.
Per completare il blocco deve essere premuto il tasto senza impostazioni di temperatura e tempo nella nuova riga. Dopo l’editing, il valore del numero dei cicli nel blocco diventa attivo. Premendo il tasto termina l’input del nuovo valore del numero di cicli ( “Number of cycles”) e l’editor è pronto per l’inserimento di un nuovo blocco.
Si deve poi specificare il tipo di ogni blocco “incluse le misure ottiche” e se necessario impostare una differenza di temperatura sulla griglia, durata e incremento di temperatura (vedi corrispondenti sezioni del manuale).
Differenza di temperatura sulla griglia del blocco termico
L’uso della differenza di temperatura fa si che sia possibile introdurre il gradiente di temperatura orizzontale o verticale lungo la griglia. Il valore massimo del gradiente sulla griglia è uguale a ±10°С.
Per specificare la differenza di temperatura sulla griglia procedere come segue:
1. Indicare l’opzione nella finestra Amplification program editor.
2. Nella riga della tabella corrispondente al programma di amplificazione, usare il tasto per attivare la finestra Use of temperature difference (Fig.7).
3. Selezionare il tipo di gradiente ( o ).
Fig.7. Gradiente verticale
4. Per introdurre un gradiente nelle caselle ti testo selezionare il simbolo del gradiente e inserire la temperatura del bordo frontale della griglia se si seleziona il gradiente verticale, o se si seleziona il gradiente orizzontale, del bordo destro della griglia.
Fig.8. Gradiente orizzontale con l’opzione per le “strip” (strisce)
Se si seleziona il gradiente orizzontale, può apparire l’opzione e in questo caso si otterrà la casella della griglia 8x8 con la linearità del gradiente migliorata (area colorata nella Fig. 8).
Incremento di tempo
L’uso del “Time increment” consente di cambiare la durata di un dato livello di temperatura per ogni successivo ciclo attraverso il valore di incremento programmato.
Per programmare il valore dell’incremento di tempo procedere come segue:
1. Selezionare l’opzione nella finestra dell’Amplification program editor.
2. Nella riga corrispondente della tabella del programma di amplificazione, premere il tasto
per attivare la finestra Use of increment (Fig. 10).
3. Selezionare l’opzione Use time increment (dopo di che la casella dell’imput per incrementare la durata, diventerà attiva ).
4. Inserire il valore di incremento.
5. Per completare l’ input, cliccare OK, per rifiutare – cliccare Cancel.
Durante l’editing del valore di incremento, la durata del livello di temperatura viene automaticamente ricalcolata per ogni successivo ciclo e viene visualizzata graficamente come funzione del numero dei cicli
Fig.9. incremento della durata
Incremento di temperatura
Utilizzando “l’incremento di temperatura” si può cambiare il valore della temperatura della griglia implementando un dato livello di temperatura per ogni successivo ciclo, attraverso il valore di un parametro programmato.
Per specificare il valore di incremento di temperatura procedere come segue:
1. Selezionare l’opzione nella finestra Amplification program editor.
2. Nella riga corrispondente della tabella con il programma di amplificazione premere il tasto per attivare la finestra Use of increment (Fig.11) per editare l’incremento di temperatura
3. Selezionare l’opzione Use increment in temperature.
4. Inserire il valore di incremento di temperatura o il valore del livello di temperatura per il ciclo finale dei blocchi (l’incremento sarà automaticamente calcolato) .
5. Per completare l’input, cliccare ОK, per rifiutare – cliccare il tasto Cancel.
Durante l’editing del valore di incremento, il livello di temperatura viene automaticamente ricalcolato per ogni successivo ciclo e viene visualizzato graficamente come funzione del numero del ciclo.
Translation - Serbo-Croat Uvod
1.1 Namena programa RealTime_PCR v.7.3
Program RealTime_PCR v.7.3 ima namenu da kontroliše termalni cycler-a SaCycler - i da analizira dobijene rezultate programa amplifikacije. Program ima sledeće funkcije:
- Sastavljanje i uređivanje testova;
- Sastavljanje protokola za istraživanje;
- Kreiranje, pokretanje i praćenje rada programa amplifikacije;
- Analiza podataka optičkih merenja;
- Sastavljanje izveštaja o rezultatima istraživanja.
Program RealTime_PCR v.7.3 je projektovan za primenu u kliničkim laboratorijama; dakle, funkcije za kontrolu i regulaciju analize rezultata su pojednostavljene do maksimuma. Ako korisnik želi, može istovremeno da izmeni parametre za rad i analizu podataka uz pomoć dodatnih podešavanja programa RealTime_PCR v.7.3.
1.2 Osnovne karakteristike programa RealTime_PCR v.7.3
Kontrola sistema Real-Time PCR SaCycler-96.
Program je projektovan da bi upravljao termalnim cycler-om SaCycler-96 prilikom pripreme, amplifikacije i analize postignutih rezultata optičkih merenja. Interfejs program će se automatski menjati u zavisnosti od vrste priključenog uređaja.
Pojam Testa.
Kada se koriste komercijalni testovi i kada se izvode pojedinačne analize, parametri protokola su standardni i uglavnom se razlikuju po broju uzoraka i njihovom rasporedu u termičkom bloku uređaja.
U ovom programu je pod pojmom Test integrisana grupa pojedinačnih parametara protokola neophodnih za završavanje PCR-a i naredne analize.
Odeljak Test sadrži sledeće parametre protokola:
1. Stanje temperature amplifikacije (program amplifikacije).
2. Vrsta korištenih uzoraka: uzorci koji se koriste u analizi, kontrole, uzorci za kalibraciju (“standardni”), njihova količina i koncentracija (za “standardne”).
3. Vrste fluorofora (fluorescentna etiketa) i svrha odgovarajućih signala (specifičnosti, unutrašnja kontrola, itd.).
4. Volumen reakcione smeše.
5. Dodatne informacije o istraživanju: naziv testa, opis uzoraka, itd..
6. Vrsta analize rezultata.
Kada se pokrene protokol ispitivanja dovoljno je navesti nazivtesta (u ovom slučaju svi neophodni parametri će automatski biti preuzeti), broj uzoraka i njihov raspored u termičkom bloku.
Režim multi-testa za analizu polimorfizama (topljenja).
Dva režima rada programa nalaze se u različitim prozorima:
- Alati za upravljanje
- Prikaživač arhive podataka
omogućavaju istovremeno upravljanje uredjajem i analiziranje prethodnih pokretanja.
Mogućnost istovremenog rada sa više alata ostvaruje se kroz dve metode:
Režim jednog prozora (Single-window mode). Program RealTime_PCR v.7.3 pokreće se samo jedanput, nezavisno od broja uredjaja koji se napajaju i koji su priključenih na kompijuter i omogućava praćenje rada samo jednog odabranog uredjaja. Uredjaj, čiji rad želi da se prati, odabira se klikom na taster i u prozoru List of devices (lista uredjaja) (Slika. 3) koji se pojavljuje na ekranu za vreme pokretanja programa ili preko menija Settings/List of devices (podešavanja/ lista uredjaja).
Režim više prozora (Multi-window mode). Da bi se pratio rad svih uredjaja koji se napajaju, program RealTime_PCR v.7.3 se pokreće u pojedinačnom prozoru. Ovaj režim omogućava istovremeno praćenje rada više uredjaja.
Mogućnost podešavanja vertikalnog i horizontalnog temperaturnog gradijenta u termičkom bloku.
Dva alternativa metoda analize krive DNK prikupljenog u fazi PCR-a (lančana reakcija polimeraze): metod paga (Ct) i metod oblika krive (Cp), koji se zasnivaju na različitim pristupima odredjivanja karakterističnog ciklusa amplifikacije.
Metoda praga (Ct) zasniva se na povlačenju linije “praga” paralelnom sa osom X i na odredjivanju broja reakcionih ciklusa (threshold cycle) u kojima linija praga seče amplifikacionu krivu epruvete. Ciklus praga je jedna od verzija karakterističnih ciklusa.
Metoda oblika krive (curve shape method) (Cp) zasniva se na matematičkoj analizi oblika krive DNK prikupljenog u procesu PCR-a.
Tokom analize optičkih merenja, program RealTime_PCR v.7.3 koristi unapred podešen metod oblika krive (Cp). U slučaju nestandardne situacije, kada se amplifikaciona kriva značajno razlikuje od standardne krive DNK prikupljenog u toku PCR-a (sigmoidna), analiza rezultata će se obavljati preko metode praga (Ct) koja će u ovakvim slučajevima dati tačniju sliku. Nove vrste analiza;
Analiza polimorfizama (topljenje)
HLA DRB
Biocenoza
Pored toga, tokom rada programa mogu se dodati druge vrste analiza rezultata optičkih merenja.
1.3 Opis programskog menija RealTime_PCR v.7.3
Osnovni meni RealTime_PCR v.7.3 programa sastoji se iz četiri odeljka:
Režim rada
Test
Podešavanja
Pomoć
Odeljak režim rada prati rad programa i obuhvata sledeće komande:
Device Handling (Upravljanje uređajem) – komanda se aktivira u režimu Archive Viewer (prikazivač arhiva) i koristi se za prelaz na Device handling (upravljanje uređajem).
Data Archive Viewer (pokazivač arhiviranih podataka) – komanda je aktivna u režimu Device handling i služi za prelaz na režim Archive Viewer.
Amplification program Editor – otvara prozor editor amplifikacionog programa.
Video-archive Viewer – prikazuje prozor Video-archive viewer (prikazivač video arhiva).
Exit – izlaz iz odeđenog programskog režima i zatvaranje prozora istog.
Odeljak Test koristi se za sastavljanje i uređivanje testova i uključuje sledeće komande:
Create/Edit test – prikazuje prozor za sastavljanje novog Testa ili editing već postojećeg.
Add a group of tests from the file– prikazuje prozor Dodaj grupu testova iz datoteke za izbor datoteke sa testovima za dodavanje.
Odeljak Settings (Podešavanja) koristi se za prikaz i uređivanje podešavanja uređaja i sastoji se iz sledećih komandi:
Konfiguracija:
Čuvanje tekućih konfiguracija ili u predefinisanom podešavanju ili u datoteci sa ekstenzijom *.rtc;
Preuzmanje standardnih konfiguracija (fabričkih) ili konfiguracija iz datoteke sa ekstenzijom*.rtc.
View Image – prikazuje prozor View Image za unošenje izmena u uređaj i njegovu dijagnostiku.
Set exposition – prikazuje prozor Set exposition za unošenje izmena u urođaj i njegovu dijagnostiku.
Last Run in device – očitava rezultate optičkih merenja poslednjeg izvršenja.
List of devices – prikazuje listu uređaja - List of devices- za priključivanje ili isključivanje.
Device diagnostics:
Prikazuje prozor trake sa komandama -Command line- za dijagnostiku mikrokontrolera alata:
Prikazuje prozor Monitornig za stalni prikaz potrebnih informacija za dijagnostiku uređaja;
Merenje visine epruvete – pokretanje postupka za merenje visine epruvete
Čuvanje dobijenih vrednosti za obavljanje sledećih optičkih merenja;
Prikaz prozora za očitavanje SD card-a (Reading SD card);
Prikaz prozora Browsing of instrument video-archive;
Options – prikaz prozora sa opcijama (Options) za korisnička podešavanja i konfiguraciju parametara za analizu.
Miscellaneous – prikaz prozora koeficijenata (List of setting coefficients).
Odeljak Help sadrži on line uputstvo RealTime_PCR v.7.3 programa i informacije o programskoj verziji:
2 Pokretanje programa
Program RealTime_PCR v.7.3 može da se pokrene na dva načina:
1. Iz rubrike Start koja se nalazi u meniju operativnog sistema Windows:
Start → All programs → RealTime_PCR → RealTime_PCR
2. Klikom na ikonu na Desktop-u (kada instalirate program, ova ikona se automatski pozicionaira na desktop-u).
Posle pokretanja programa, prozor za izbor režima programskog rada (Slika 1) prikazaće na ekranu:
Slika.1. Prozor za izbor programskog režima rada
U ovom prozoru moraju se izvršiti sledeće operacije::
Biranje postojećeg operatera ili dodavanje novog operatera.
Izbor postojećeg operatera vrši se sa liste Operatera.
Dodavanje novog operatera vrši se izborom rubrike Add Operator (dodaj operatera) sa liste Operatera.
Izborom rubrike Add Operator pojavljuje se u prozoru Add Operator koji je prikazan na ekranu. (Slika 2)
Slika 2. Prozor „Dodaj operatera”
U ovom prozoru potrebno je popuniti polja Operator i Directory.
Ime operatera treba staviti u polja Operator.
Polje Directory pokazuje put foldera operatera na hard disku kompjutera (za izbor foldera, kliknuti na taster Browse). Ako unesete ime operatera, sve datoteke (protokoli, program amplifikacije, itd.) biće sačuvani u tom folderu, osim ako nije drugačije naznačeno.
Kliknite na OK da biste sačuvali unesene podatke i da biste se vratili na prozor za izbor programskog rezima rada.
Odabir jednog programskog režima od moguća dva:
Režim Device handling (upravljanje uređajem) (prozor ) omogućava vam:
Sastavljanje i uređivanje testova;
Kreiranje i uređivanje amplifikacionih programa;
Sastavljanje i uređivanjeprotokola narednih pokretanja;
Monitoring statusa programa amplifikacije;
Dijagnostiku i modifikaciju uređaja.
Režim Data archive viewer (prikazivač arhive podataka) (prozor ) omogućava vam:
Analizu podataka optičkih meranja iz sačuvanih protokola;
Uređivanje izveštaja o rezultatima merenja.
Napomena: moguće je izvršiti simultane operacije u dva režima (npr. izvršiti analizu prethodno dobijenih podataka u toku rada programa amplifikacije).
3 Režim „rukovanje uređajem“
3.1 Namena različitih režima
Režim Device Handling RealTime_PCR v.7.3 programa namenjen je sastavljanju protokola, pravljenju programa amplifikacije, amplifikaciji i podešavanju parametara uređaja. U ovom režimu koristi se prozor .
Za ulazak u ovaj režim, možete upotrebiti jedan od sledećih načina:
1. Biranje režima Device Handling pri pokretanju programa RealTime_PCR v.7.3.
2. Biranje opcije Device Handling iz menija Mode u prozoru Archive.
3. Klik na ikonu u prozoru Archive.
Prozor liste uređaja (List devices) prikazaće se na ekranu u vidu liste uređaja koji su priključeni na kompjuter. (Slika 3).
Slika.3.Prozor priključenih uređaja
Da biste mogli da koristite određeni uređaj, potrebno je da ga izaberete sa liste i da kliknete na taster . Program RealTime_PCR v.7.3 pokrenuti će izabrani uređaj. Da biste pokrenuli drugi uređaj (režim jednog prozora) potrebno je da isključite prethodno izabrani uređaj klikom na taster , zatim da izaberete novi uređaj sa liste i da ponovo kliknete na taster .
U režimu više prozora, da biste koristili sve uređaje potrebno je pokrenete program u jednom prozoru, koristeći jedan od gorepomenutih načina. U tom slučaju je moguće pratiti rad više uređaja istovremeno.
Rad u režimu Device Handling sastoji se iz nekoliko koraka:
1. Pripremanje uređaja za rad (podešavanje parametara uređaja, ekspozicija, itd.).
2. Sastavljanje protokola za ispitivanje i označavanje parametara amplifikacije.
3. Pokretanje programa amplifikacije.
Konfiguracija parametara uređaja obično se radi tokom instalacije od strane specijalizovanog osoblja i ovaj proces je objašnjen u odeljku “Podešavanja i dijagnostika uređaja” ovog priručnika.
Da bi se pojednostavio proces izrade protokola preporučujemo da sačuvate parametre standardnih protokola u obliku Testa.
3.2 Sastavljanje/uređivanje testa (samo za verziju SaCycler-96 RUO)
3.2.1 Sastavljanje novog testa
1. Za sastavljanje novog testa izaberite opciju Create/Edit test iz menija Test u prozoru RealTime_PCR v.7.3 i kliknite na taster Create a new test.
2. U prozoru koji se pojavljuje
Unesite naziv novog testa i kliknite na OK. Prozor Test će se prikazati na ekranu.
3. Unesite parametre testa u odgovarajuća polja u prozoru Test. (vidi odeljak 3.2.3).
4. Kliknite na OK da biste sačuvali parametre i zatvorite prozor Test.
3.2.2 Uređivanje testa
1. Za uređivanje testa izaberite opciju Create/Edit test iz menija Test u prozoru RealTime_PCR v.7.3.
2. U prozoru koji se pojavljuje
Izaberite test sa liste i kliknite na taster . Prozor Test pojaviće se na ekranu (Slika 4).
3. Izmenite potrebno polje u prozoru Test (vidi 3.2.3).
4. Kliknite OK da biste začuvali unesene parametre i zatvorite prozor Test.
3.2.3 Parametri testa
Opis testa i parametara navedeni su u prozoru Test.
“Padajuća” lista Test namenjena je odabiru testa. Odabirom jednog elementa sa liste, parametri izabranog testa prikazaće se u prozoru Test.
Preporučujemo da navedete namenu testa i njegove karakteristike u polju Description.
Slika 4. Prozor “Test”
Unesite Parametre neophodne za rad PCR-a i analize rezultata.
Napomena:Ako koristite komercijalne testove, neophodni parametri navedeni su u opisu testova.
Opis parametara:
Analiza
U odeljku Analiza izaberite parametre Tip i Metodu analize.
Tip
Ova verzija programa obezbeđuje sledeće tipove analiza:
Kvalitativna– određuje prisustvo ili odsustvo određenog fragmenta ciljnog DNK u uzorku. Rezultati su prikazani u vidu sledećih vrednosti: ili “pozitivno” ili “negativno” (“ ” ili “-“ ). Ako koristite unutrašnje kontrole, stepen pouzdanosti rezultata će biti približan.
Kvantitativna analiza sa standardom – procena apsolutnog iznosa fragmenata ciljnog DNK-a u uzorku. Da biste uradili analizu potrebno je izvršiti kalibraciju uzoraka (standardnih)- uzorci sa određenim iznosom ciljnih DNK.
Relativna – procena relativnog iznosa fragmenata ciljnog DNK u uzorcima koji se analiziraju. Iznos DNK u svim uzorcima, izračunava se u odnosu na referentan uzorak po izboru korisnika. Bilo koji uzorak može biti izabran kao referentan uzorak.
Kriva topljenja– procena tačke topljenja proizvoda amplifikacije. Analiza zahteva korištenje fluorescentnih boja koje se vezuju (interkalatne), tipa SYBR.
Analiza polimorfizama (dve probe) – analiza genetskih polimorfizama, npr. pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP) korištenjem dva različita fluorofora u jednoj epruveti. Analiza je orijentisana ka simultanoj amplifikaciji dve verzije alela u jednoj epruveti i njihovom određivanju kroz dva razlicita fluorofora. Procena rezultata se vrši kroz prisustvo i vrednost relativnog pomeranja amplifikacionih krivih zabeleženog u jednoj epruveti sa dva fluorofora (dCp ili dCt).
Analiza polimorfizama, fuzija (topljenje).
HLA DRB – Genotipizacija (HLA tipizacija).
GMI – određivanje prisustva i koncentracije genetski modifikovanih sastojaka u uzorcima.
Biocenoza – ispitivanje biocenoze.
Multiplex utvrđivanje – istovremeno određivanje broja (do 4/5) fragmenata ciljnog DNK.
Metoda
U programu se koriste sledeće metode analize:
Threshold (Ct) – određivanje ciklusa praga amplifikacije Ct (threshold cycle). Ova metoda zasniva se na povlačenju linije “praga” (threshold) i na određivanju broja ciklusa u kojima amplifikaciona kriva preseca liniju praga svakog uzorka.
Napomena: Za promenu vrednosti ciklusa praga kliknite na Additional i parametar “2. Threshold value” u prozoru Additional parameters.
Za više detalja o dodatnim parametrima, pogledajte odeljak “Setting analysis parameters” (Podešavanje parametara za analizu).
Oblik krive (Cp) – određivanje distinktivnog ciklusa na osnovu matematičke analize oblika amplifikacione krive.
Epruvete
Izaberite vrstu uzoraka koji će biti korišteni tokom ispitivanja.
Sample – uzorak koji se ispituje;
Standard – kalibracioni uzorak potreban za kvantitativnu analizu;
Control – referentan pozitivan uzorak ;
Control – – referentan negativan uzorak.
Standard
Prilikom odabira Kvantitatvne analize sa standardom (Quantitative with standards), potrebno je da opišete korištene kalibracione uzorke (“standardne”).
U tu svrhu, sledeće informacije moraju biti navedene:
Uneti u polje Quantity – količinu različitih koncentracija kalibracionih uzoraka (“standardnih”).
U polje Copy – navesti broj epruveta za svaku koncentraciju kalibracionog uzorka (“standardnih”).
Popuniti tabelu vrednosti “standardnih” (navesti naziv i koncentraciju za svaki “standardni”).
Broj redova u tabeli odgovara broju varijanata “standardnih”. Programirajte naziv za svaki “standardni” (u predefinisanom podešavanju biće “Standard_1”, “Standard_2” i itd.) i navedite vrednosti (koncentraciju “standardnog”). Jedinice mere (kopije, pikogrami, IU) mogu se izabrati sa liste iz naslova kolone u desnoj strani tabele.
Tabela sa vrednostima može da se popuni ili ručno ili automatski. Za automatsko popunjavanje kliknite na taster Serial titration (Serijsko titriranje), u odgovarujećem prozoru popuniti polje Initial value i Titration step i kliknuti na OK.
Podaci “standardnih” u vrednosnim tabelama mogu se prikazati u dva formata: uobičajenom i naučnom. Izbor prezentacije formata vrši se preko alternatora Formata.
Primer. Unesite cifre i u uobičajen i u naučni format (u naučnom formatu stepenovanje broja sa osnovom 10 (eksponent) mora biti označeno posle slova “E”).
Uobičajeni Naučni
5 5,00Е 00
15 1,50Е 01
250 2,50Е 02
9 500 9,50Е 03
18 500 000 1,85Е 07
Kontrole
U odeljku kontrole potrebno je navesti broj epruveta sa referentnim uzorcima korištenih pri ispitivanju.
Pozitivan (K ) – broj epruveta sa pozitivnim referentnim uzorcima.
Negativan (K-) – broj epruveta sa negativnim referentnim uzorcima.
Napomena: Broj epruveta sa kalibracijom i referentnim uzorcima može biti promenjen u slučaju potrebe tokom pripreme protokola za istraživanje (vidi “razvoj protokola”).
Volumen miksture
U odeljku Volumen smeše (Mixture volume) mora biti naveden volumen reakcione smeše, ne uzimajući u obzir volumen ulja i parafina (ako su korišteni).
Radi preciznog održavanja uslova temperature amplifikacije, uređaj SaCycler-96 koristi “aktivan” metod regulacije temperature reakcione smeše unutar epruvete. Metod je zasnovan na primeni matematičkog modela reakcije u epruveti i zahteva precizno podešavanje volumena reakcione smeše.
Fluorofori
Tabela Fluorophors sadži uputstvo za namenu svakog fluorofora u analizi rezultata:
Specifics – osnovni specifični znak.
IC – znak iz unutrašnjeg referentnog uzorka.
U slučaju nekorištenja određenog fluorofora, u tabeli treba izabrati opciju absent.
Ako izaberete tip analize Analysis of polymorphisms (two probes), namena fluorofornog signala može biti navedena (predefinisano podešavanje biće “Version 1” i “Version 2”).
Standardi za analize polimorfizama (dve probe)
Odeljak se aktivira ako izaberete vrstu analize Analysis of polymorphisms (two probes).
Ako analizu polimorfizama vršite korištenjem dve probe, procena rezultata će se vršiti kroz prisustvo i vrednost relativnog pomeranja amplifikacione krive zabeleženog u epruveti za dva fluorofora (dCp or dCt). Ako nema nikakvog pomeranja ili je ono ispod vrednosti označene u polju Heterozygote dCp, rezultat će se smatrati heterozigotnim, tj. obe vezije koje se analiziraju su prisutne. Ako je pomeranje iznad vrednosti označene u polju Homozygote dCp, rezultat će se smatrati homozigotnim, tj. prisutna je samo jedna verzija – sa vrednošću ispod Cp-a. U ostalim slučajevima rezultat se smatra neodređenim i traži se ponovno ispitivanje.
Program amplifikacije
U odeljku Amplification program, program amplifikacije se mora odabrati na jedan od sledećih načina:
Izabrati prethodno na disku arhiviran program, klikom na ,
Kreirati novi program amplifikacije klikom na ,
Uređivanje programa amplifikacije klikom na .
Izabrani program amplifikacije pokazaće se u ovom odeljku.
Za više detalja o kreiranju i uređivanju programa amplifikacije vidi odeljak 3.3 Kreiranje i uređivanje programa amplifikacije.
Dodatni parametri
Kliknuti na Additional za otvaranje prozora Parameters of the analysis.
Vidi odeljak 8. Setting of analysis parameters za opis dodatnih parametara analize.
PAŽNJA! Ovaj odeljak je namenjen isključivo korisnicima sa iskustvom. U većini slučajeva nije neophodno promeniti vrednosti parametara u predefinisanom podešavanju. Promene ovih parametara biće sačuvane u programskim podešavanjima i u budućnosti bi mogle da izazovu pogrešno tumačenje rezultata.
3.3 Kreiranje programa PCR (samo za verzije SaCycler-96 RUO)
3.3.1 Kreiranje novog programa amplifikacije
Novi program amplifikacije moguće je kreirati u različitim etapama rada programa RealTime_PCR v.7.3:
1. Za sastavljanje i uređivanje testa:
Otvoriti prozor Test (vidi pasus 3.1.2).
Kliknuti na taster Create new program u odeljku 8. Amplification program.
2. Pre pokretanja programa amplifikacije:
Izabrati opciju Start program u prozoru RealTime_PCR.
Kliknuti na taster Create new program.
3. Kada se pokrene Editor programa amplifikacije:
Izaberi meni u prozoru Amplification program editor:
- Kreiranje novog programa.
Pri kreiranju novog programa amplifikacije, na jedan od dva označena načina, na ekranu će se pojaviti prozor Amplification program template. Struktura programa amplifikacije može se kreirati uz pomoć šablona.
Novi program amplifikacije može se kreirati sa ili bez korištenja Amplification program template.
Kreiranje novog programa amplifikacije uz pomoć šablona (Amplification program template)
Da bi se kreirao novi program amplifikacije koristeći šablon, postupite na sledeći način:
1. Izaberite opciju Create amplification program (vidi 3.3.1) i otvoriće se prozor Amplification program editor i prozor Amplification program template.
Prozor Amplification program template (slika 5) šematski predstavlja delove programa amplifikacije: jedinica sa dve-tri faze temperaturnih ciklusa, režim pripremnog zagrevanja i održavanja.
2. Izaberite najpogodniji šablon.
Slika5. Prozor „Amplification program template”
3. Ako je potrebno dodajte režime Preliminary heating (pripremno zagrevanje) i Holding mode (režim održavanja) (označiti odgovarajuća polja).
4. Posle odabira šablona, kliknite na Apply.
Programirane informacije u šablonu pojaviće se u prozoru Amplification program editor (Slika 6).
5. Uređivanje programa amplifikacije:
Unesite naziv programa u polje Program name
Ako je potrebno, popunite polje Description
Izmenite potrebne podatke u tabeli programa amplifikacije.
Slika.6. Prozor „Amplification program editor”
Izmena podataka u tabeli programa amplifikacije
Svaki red u tabeli odgovara jednom temperaturnom nivou programa amplifikacije. Temperaturni nivoi mogu se objediniti u blokove. Broj linija jednog bloka odeđuje količinu temperaturnih nivoa u određenoj fazi rada programa. Blokovi su u tabeli razdvojeni praznim redovima.
Dodavanje ili uklanjanje temperaturnih nivoa može se izvršiti klikom na tastere (taster će biti aktivan tek nakon završenog uređivanja drugih redova) i .
U svakom redu (za svaki temperaturni nivo) moraju biti unesene sledeće informacije:
1. Nivo temperature - ;
2. Trajanje nivoa - e ;
3. Prisustvo optičkih merenja - .
PAŽNJA! Dozvoljeno je samo jedno optičko merenje u okviru jednog bloka.
Izbegavajte temperaturna polja i vremenske vrednosti koje su bez programskog unosa. (!)
Dodavanje ili uklanjanje blokova može se izvršiti klikom na tastere i .
Za svaki blok mora se označiti tip bloka.
1. Cycle (označen je u predefinisanom podešavanju prilikom kreiranja bloka) – prethodno podešava režim ponavljanja izvršenja programa u određenoj fazi sve do završetka određenog broja programiranih ciklusa;
2. Pause – zaustavlja izvršenje programa;
3. Holding – podešava temperaturu održavanja posle izvršenja programa;
Pažnja! Režim "Holding" (održavanje) može se podesiti samo na kraju programa.
4. Krive topljenja– služe za dobijanje krivih topljenja za procenu dužine delova amplifikacije.
Odabir opcije Melting curve omogućava kreiranje temperaturnog bloka iz samo jednog nivoa, sa početnom temperaturom od 90°C, brojem i podizanjem temperature na svakom nivou jednakim sa -0.5°C. Početni parametri bloka “Melting curve” mogu se izmeniti.
Broj ciklusa mora biti označen za svaku jedinicu.
Ako je potrebno, za svaki temperaturni nivo može se dodatno programirati sledeće:
Temperaturne razlike prema šablonu (predstavljen u tabeli amplifikacije, u koloni označenoj sa );
Vremenski porast - upcount (predstavljen u tabeli amplifikacije, u koloni označenoj sa ).
Temperaturni porast (predstavljen u tabeli amplifikacije, u koloni označenoj sa ).
Za prikaz navedenih parametara, potrebno je označiti odgovarajuća polja u tabeli:
U odgovarajućim odeljcima ovog priručnika opisano je kako urediti navedene parametre.
Tokom kreiranja/uređivanja programa amplifikacije, u donjem delu prozora Amplification program editor pojaviće se grafički prikaz programa amplifikacije. Pri svakoj izmeni vrednosti temperaturnog nivoa, njenog trajanja, broja temperaturnih blokova, broja ciklusa, nazivi vrste bloka, itd., izmene će biti prikazane u grafičkom prikazu programa amplifikacije.
Vrednost temperaturnog nivoa može se izmeniti uređivanjem grafičkog prikaza programa amplifikacije. Da bi se to uradilo potrebno je usmeriti kursor miša na nivo temperature (strelica će dobiti oblik ) i držati stisnut levi taster miša radi podešavanja (vertikalno) željenog temperaturnog nivoa.
Prikaz dijagrama programa amplifikacije može se izmeniti uz pomoč brzog menija (pokreće se desnim tasterom na mišu) koji sadrži sledeće stavke:
Prikaz temperaturnog nivoa
Prikaz vremenskog trajanja
Prikaz informacija o gradijentu i porastu (temperaturna razlika kroz tabelu, porast vremena i temperature)
Izmena rezolucije dispozicije nivoa (pojavljuje se prozor koji omogućava izbor jedne od tri vrednosti rezolucije dispozicije nivoa: 1°C, 0,5°C , 0,1°C).
Kreiranje novog programa amplifikacije bez šablona programa amplifikacije.
Da bi se kreirao novi amplifikacioni program bez šablona, moraju se izvršiti sledeći koraci:
1. Izaberite opciju Create amplification program (vidi 3.2.1). Pojaviće se prozor Amplification program editor i prozor Amplification program template.
2. Kliknite na taster Cancel u prozoru Amplification program template.
3. Unesite naziv programa u polje Program name.
4. Ako je potrebno, popunite polje Description.
5. Popunite tabelu programa amplifikacije analogno sa kreiranjem programa amplifikacije, korištenjem jednog šablona.
Napomena: Tabela programa amplifikacije može biti popunjena u oba slučaja korištenjem tastera edit na desnoj strani tabele i tastature.
Popunjavanje tabele programa amplifikacije korištenjem tastature:
Za popunjavanje tabele programa amplifikacije korištenjem tastature, polja koja označavaju temperaturu i vreme (minuti, sekunde) moraju biti naknadno popunjena. Unos svake nove vrednosti mora biti završen pritiskom na taster .
Posle unosa svih parametara (temperature, minuta i sekundi) tekućeg reda, automatski će se pojaviti novi red, u istom bloku, sa praznim poljima za unos parametara.
Da biste završili popunjavanje jednog bloka, potrebno je da kliknete na bez podešavanja temperature i vremena u novom redu. Posle obrade, vrednost brojeva ciklusa u bloku aktiviraće se. Klikom na taster završava se unos nove vrednosti broja ciklusa ( “Number of cycles”) i editor je spreman za unos novog bloka.
Zatim je potrebno označiti tip svakog bloka “uključujući optička merenja” i, ako je neophodno, podesiti u tabeli temperaturnu razliku, trajanje i uvećanje temperature (vidi odgovarajuće odeljke u priručniku).
Temperaturna razlika u tabeli termičkog bloka
Upotreba temperaturene razlike omogućava uvođenje horizontalnog i vertikalnog temperaturnog gradijenta duž tabele. Maksimalna vrednost gradijenta u tabeli jednaka je ±10°С.
Da biste odredili temperaturnu razliku u tabeli, postupite na sledeći način:
1. Označite opciju u prozoru Amplification program editor.
2. U redu tabele koji odgovara programu amplifikacije, kliknite na taster za aktiviranje prozora Use of temperature difference (Slika 7).
3. Izaberite tip gradijenta ( o ).
Slika.7. Vertikalni gradijent
4. Za unošenje gradijenta u polje testa izaberite simbol za gradijent i unesite temperaturu prednje ivice tabele, ako izaberete vertikalni gradijent, a ako izaberete horizontalni gradijent, desne ivice tabele.
Slika .8. Horizontalni gradijent sa opcijom za “strip” (trake)
Ako izaberete horizontalni gradijent, može se pojaviti opcija i u tom slučaju dobićete polje u grafikonu 8x8 sa poboljšanom linearnošću gradijenta (osenčena površina na Slici 8).
Porast vremena
Korištenje “Time increment” omogućava promenu trajanja određenog nivoa temperature za svaki sledeći ciklus kroz vrednost programiranog porasta.
Da biste programirali vrednost porasta vremena, postupite na sledeći način:
1. Izaberite opciju u prozoru Amplification program editor.
2. U odgovarajućem redu u tabeli programa amplifikacije, kliknite na taster
da biste otvorili prozor Use of increment (Slika 10).
3. Izaberite opciju Use time increment (posle toga će se polje za unos porasta vremena aktivirati ).
4. Unesite vrednost porasta.
5. Da biste potvrdili unos kliknite na OK, za odbijanje kliknite na Cancel.
Za vreme obrade vrednosti porasta, trajanje nivoa temperature automatski se izračunava za svaki sledeći ciklus i grafički je prikazana kao funkcija broja ciklusa.
Slika 9. Porast trajanja
Porast temperature
Odabirom opcije “Increment in temperature” možete izmeniti vrednost temperature u grafikonu, dobijanjem određenog nivoa temperature za svaki sledeći ciklus, kroz vrednost programiranog parametra.
Da biste odredili vrednost porasta temperature, postupite na sledeći način:
1. Izaberite opciju u prozoru Amplification program editor.
2. U odgovarajućem polju tabele programa amplifikacije, kliknite na taster da biste otvorili prozor Use of increment (Slika 11) za obradu porasta temperature.
3. Odaberite opciju Use increment in temperature.
4. Unesite vrednost za porast temperature ili vrednost nivoa temperature za završni ciklus blokova (porast će biti automatski izračunat) .
5. Da biste završili unos, kliknite na OK, za odbijanje kliknite na Cancel. .
U toku obrade vrednosti porasta, nivo temperature biće automatski izračunat za svaki sledeći ciklus i grafički će biti prikazan kao funkcija broja ciklusa.
English to Serbian: Automated coagulometer General field: Medical Detailed field: Medical: Instruments
Source text - English 5.1.2. System fluid container space
The system fluid container space is located under the sample changer. The system fluid container and the liquid waste container are located here. The caps of the system fluid container and liquid waste container are marked by a green and a red spot, respectively. Both containers have level sensors, fluid levels can be monitored continuously on the screen.
The washing stations provide system fluid used for the cleaning of the sampling arm and reagent dosing arm. By the end of a flushing cycle the content of both washing stations is transferred into the liquid waste container. The maintenance, repair and calibration of washing fluid dosing, transfer and liquid waste drainage system are the tasks of the service, the user has no access to that. The used washing fluid generated during the operation of Coag XL instrument should be treated as biological waste.
5.1.3. Waste space
Solid waste container is located in the waste space. Used cuvettes are transferred to the plastic bag into the solid waste container. After closing the bag it can be removed hygienically according to regulations on waste handling and disposal.
Used measuring cuvettes produced during the operation of Coag XL instrument should be handled as biological hazardous waste.
5.1.4. Reagent space
The cooled reagent storage disk is located in the reagent space. The disk contains 44 positions (16 and 28 positions for 30 mm and 22 mm outer diameter vials, respectively) for reagent and washing fluid vials. The reagent dosing arm is also located here. The reagent dosing arm performs circular motion with a specified radius and also moves vertically; during its motion it reaches the reagent storage disk, the thermostated measuring space and cuvette incubator disk and also a washing station.
The reagent dosing arm contains a capacitive level sensing pipetting item. Based on displacement principle the arm aspires reagents from the reagent vials located in the reagent storage disk then it transfers the required volume into the measuring cuvette. The reagents will be thermostated onto the measurement temperature (i.e. reagents are incubated) in the reagent dosing arm. The cuvette moving arm and the reagent dosing arm were built with axes with the same center.
The cuvette moving arm and the reagent dosing arm were built with axes with the same center. It performs circular motion with a specified radius and also moves vertically. During its motion it reaches the cuvette incubator disk, the measurement space and the disposal rail. It transfers the cuvette from the cuvette incubator disk to the required measurement position, after dosing the reagent it performs the mixing step; then after the completion of the measurement it pulls out the used cuvette from the measurement position then transfers it onto the disposal rail. From there the cuvette is transferred into the solid waste container through the disposing slot. The task of the external reagent container is to contain the diluting buffers and the washing fluid. There is a specific built-in site for emergency samples, calibrator and control samples.
5.1.5. Measurement space
The measurement space consists of 8 nephelometric positions (channels); of those 4 on the right and 4 on the left are capable to perform turbidimetric and photometric measurements, respectively. The positions are built in a measurement block with electronic temperature control. Each channel of the optical measurement system is built in with light emitting diodes (LED) light sources of sufficiently narrow wavelength and photodiode sensors. The channels sense the dosing of the sample and the reagent and the placement and removal of the cuvette, ensuring the error-free functioning of this part of the instrument. The software records the reaction curves of measurements running at the channels automatically.
Translation - Serbian 5.1.2. Prostor za kontejner sistemske tečnosti
Prostor za kontejner sistemske tečnosti nalazi se ispod izmenjivača uzoraka. Kontejner sistemske tečnosti i kontejner za tečni otpad smešteni na tom mestu. Poklopci kontejnera za sistemsku tečnost i kontejnera za tečni otpad obeleženi su zelenom odnosno crvenom oznakom. Oba kontejnera imaju senzore nivoa i nivo tečnosti može kontinuirano da se prati na ekranu.
Stanica za ispiranje obezbeđuje sistemsku tečnost koja se koristi za čišćenje ručice za uzorkovanje i ručice za doziranje reagenasa. Na kraju ciklusa ispiranja sadržaj obe stanice za pranje prenosi se u kontejner za tečni otpad. Održavanje, popravke i kalibracija doziranja tečnosti za pranje, prenos i drenažni sistem tečnog otpada zadatak su servisnog osoblja, korisnik nema odobrenje da to uradi. Upotrebljena tečnost za pranje koja nastaje tokom rada automatskog koagulometra Coag XL , mora biti tretirana kao tečni otpad.
5.1.3. Prostor za odlaganje otpada
Kontejner za čvrst otpad nalazi se u prostoru za odlaganje otpada. Upotrebljene epruvete u plastičnim kesama odlažu se u kontejner za čvrst otpad. Nakon što se kesa zatvori, otpad može biti uklonjen na higijenski način u skladu sa pravilima o tretiranju i odlaganju otpada.
Upotrebljene kivete za merenje, koje nastaju tokom rada aparata Coag XL, moraju biti tretirane kao opasan biološki otpad.
5.1.4. Prostor za reagense
Rashladni disk za skladištenje reagenasa nalazi se u prostoru za reagense. Disk sadrži 44 pozicije (16 odnosno 28 mesta za epruvete sa prečnikom od 30 mm odnosno 22 mm) za reagense i epruvete sa tečnošću za pranje. Ručica za doziranje reagenasa takođe se nalazi na tom mestu. Ručica za doziranje reagenasa izvodi kružne pokrete određenog prečnika a pomera se i vertikalno; tokom svog kretanja stiže do diska za skladištenje reagenasa, termostatiranog mernog prostora i diska za inkubaciju kiveta a i do stanice za ispiranje
Ručica za doziranje reagenasa ima jedinicu za pipetirenje sa kapacitivnim senzorom nivoa. Na osnovu principa premeštanja, ručica uvlači reagens iz reagens bočice koja se nalazi u disku za skladištenje a zatim određenu količinu prebacuje u kivetu za merenje. Reagensi će biti termostatirani na temperaturi merenja (tj. reagensi će biti inkubirani) u ručici za doziranje reagenesa. Hvataljka za premeštanje kiveta i ručica za doziranje reagenasa nalaze se na osovini sa istim centrom.
Hvataljka za premeštanje kiveta i ručica za doziranje reagenasa nalaze se na osovini sa istim centrom. Ona izvodi kružne pokrete određenog prečnika a pomera se i vertikalno. Tokom svog kretanja stiže do diska za inkubaciju kiveta, prostora za merenje i stalka za odlaganje. Ona premešta kivete iz diska za inkubaciju kiveta do tražene pozicija za merenje, a posle doziranja reagensa prelazi na mešanje; zatim, nakon završetka, upotrebljene kivete izvlači iz pozicije za merenje i premešta ih u stalak za odlaganje. Odatle se kivete premeštaju u kontejner za čvrst otpad, kroz prorez za odlaganje otpada. Funkcija spoljnog kontejnere za reagense jeste da sadrži pufere za rastvaranje i tečnost za pranje. Postoji posebno ugrađeno mesto za hitne uzorke, kalibracione i kontrolne uzorke.
5.1.5. Prostor za merenje
Prostor za merenje sastoji se od 8 nefelometrijskih pozicija (kanala); 4 desno i 4 levo mogu da obavljaju turbidimetrijska odnosno fotometrijska merenja. Pozicije su ugrađene u merni blok sa elektronskom kontrolom temperature. Svaki kanal optičkog sistema merenja ugrađen je sa svetlećim diodama (LED), svetlosnim izvorima dovoljno uske talasne dužine i sa fotodiodnim senzorima. Kanali detektuju dozirane uzorke i reagense , kao i unošenje i uklanjanje kiveta i obezbeđuju funkcionisanje bez grešaka, ovog dela aparata. Softver beleži reakcione krive merenja koje automatski prolaze kroz kanale.
Italian (University of Belgrade - Faculty of Philology, verified) Serbian to Italian (Administration and national communities, verified) Italian to Serbian (Administration and national communities , verified)
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I am a professional translator with over 17 years of experience working with Italian, English, and Serbian.
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